在多色流式實驗中，熒光溢漏是導致通道信號難區分、設門不準確的核心原因。隨著檢測指標增多，熒光素光譜重疊的概率增加，單一熒光的溢漏會被多色疊加放大，整體熒光溢漏情況持續變化——這種情況下，未染色的空白對照（未涉及熒光溢漏干擾）或全通道同型對照（無法覆蓋多色交叉溢漏）均無法模擬全染背景，尤其對分群不明顯、低表達量指標（需從大量陰性群體中識別陽性信號），必須依賴減一對照(FMO對照，Fluorescence Minus One)排除干擾。減一對照，又稱熒光扣除對照或圈門對照，是多色流式分析中針對特定通道的陰性對照。其操作邏輯為：對目標通道不進行熒光染色，其余所有檢測通道均按目標樣本的染色方案完整染色，以此模擬“全染背景下，僅目標通道無特異性信號"的場景。

該對照主要應用于：研究不同細胞亞群的表型分子（如免疫細胞表面標志物）、細胞因子等指標的檢測，尤其適用于多色（≥3色）實驗或低表達指標分析。

1.排除全染背景干擾：通過“缺失一個通道熒光"，直觀區分“目標通道的特異性信號"與“其他通道溢漏至該通道的非特異性信號"；

2.評估熒光溢漏程度：量化其他熒光染料向目標通道的溢漏比例，為補償調節和設門提供精準依據；

3.確保設門準確性：在低表達、分群模糊的場景中，明確陰性群體的信號邊界，避免因溢漏信號誤將陰性細胞判定為陽性。

樣本中死細胞的存在會極大地影響染色效果，因為死細胞具有更大的自發熒光，而且會增加非特異性的抗體結合，導致假陽性并增加背景信號，降低陽性信號的動態范圍，這可能會使弱陽性樣本和稀有細胞群體的鑒定變得困難。還可能會釋放DNA，DNA非常黏稠，會導致細胞成團，容易堵塞管路。此外，死細胞無法刺激表達活化功能相關的標志物，從而導致一些比真實陽性率低的假陰性結果產生。使用基于FSC和SSC的門可以幫助清除部分碎片和死細胞，但無法全部移除，因此需要借助靈敏且特異性的染料對細胞進行活性分析。其原理是利用細胞死亡后的通透性改變來做特異性熒光標記，常見染料包括DNA染料類，分為兩種，一種是膜不透過性染料（如PI、7-AAD），僅標記死細胞；另一類是膜透過性染料（如 Hoechst 33342），可標記活細胞核，常用于活細胞示蹤或與 PI 聯合使用進行死活雙染。而熒光標記的Annexin V檢測凋亡細胞，可結合外翻的磷脂酰絲氨酸。此外，還可以通過對細胞大小變化及理化性質的測定進行細胞活性檢測。

其它實驗對照，用于比較特定實驗條件下樣本之間的差別，主要分為以下幾個類別：

1.陰性對照能夠提供所有待測標志物的表達背景，用于比較細胞經過化學或生物學處理后的蛋白表達差異，例如細胞內染色實驗涉及固定和破膜，這些步驟會影響抗原檢測、自發熒光、熒光染料亮度和細胞形態。

2.陽性對照用于證實抗體在相關細胞中的陽性染色，以表明抗體在實驗中起作用。

3.縱向對照/參考對照是長期研究的質量控制，可以確保實驗過程中的染色一致性。